Formen, Farben und Gemeinschaften von Mikroorganismen

Gibt man einen Tropfen Schlamm aus einem anaeroben Reaktor unter das Mikroskop und schaltet auf UV-Anregung um, leuchten Teile des Bildfeldes blaugrün auf. Es wurde nichts angefärbt. Das Leuchten stammt vom Coenzym F420, einem Molekül, das methanogene Archaea in ihrem Energiestoffwechsel nutzen. Innerhalb einer Minute und ohne einen einzigen DNA-Strang zu extrahieren, hat das Mikroskop zwei nützliche Fragen beantwortet: Sind Methanogene vorhanden, und sehen sie aktiv aus?

Die Sequenzierung ist aus gutem Grund zum Standardverfahren bei der mikrobiellen Analyse geworden. Ein 16S-Profil liefert Namen und relative Häufigkeiten, die kein Okular jemals liefern könnte. Was es jedoch nicht liefert, sind Form, Größe, Anordnung oder irgendein Hinweis darauf, ob die Zellen als freie Schwimmer in der Flüssigkeit schwammen oder in einem Biofilm auf einer Stahloberfläche angeordnet waren. Die Mikroskopie beantwortet diese Fragen nach wie vor schneller und kostengünstiger als jede andere Methode, und bei Proben, wie sie aus Gasspeichern und geothermischen Bohrlöchern stammen, sind diese Antworten selten irrelevant.

Zellmorphologie

Die meisten Einführungen in die Mikrobiologie beschränken sich auf zwei Formen. Stäbchen und Kugeln, auchKokken genannt.Diese decken ein enormes Spektrum ab und machen den Großteil der Organismen aus, denen man in einem Lehrlabor begegnet. Proben aus Salzsole, heißen Quellen und dem tiefen Untergrund sehen oft deutlich ungewöhnlicher aus.

• Unregelmäßige Kokken. Methanofollis und Archaeoglobus bilden Kugeln, die keine richtigen Kugeln sind, sondern gelappt und uneben, da beide nicht über die starre Peptidoglykanwand verfügen, die einen bakteriellen Kokken zu einer ordentlichen Kugel zusammenhält.

• Sarcina-Pakete. Methanosarcina teilt sich in mehr als einer Ebene, und die Tochterzellen bleiben zusammen, wodurch kubische Pakete aus acht oder mehr Zellen entstehen; unter bestimmten Bedingungen bilden sich sogar viel größere Aggregate.

• Spirillen. Methanospirillum wächst als gekrümmte, spiralförmige Zellen, die sich Ende an Ende innerhalb einer röhrenförmigen Hülle aneinanderreihen, sodass ein einzelnes Filament einen Großteil des Sichtfeldes einnehmen kann.

• Kurze Stäbchen. Die Zwischenform zwischen einem Stäbchen und einem Kokkus, die so häufig vorkommt, dass sie eine eigene beschreibende Kategorie hat, und so schwer einzuordnen ist, dass zwei Personen, die denselben Objektträger betrachten, sich manchmal nicht einig sind.

• Rechtecke. Haloquadratum walsbyi ist flach und quadratisch, ähnelt eher einer Briefmarke als irgendetwas anderem in der Welt der Mikroorganismen und lebt in gesättigter Sole. Seine Gasbläschen zeigen sich als helle, lichtbrechende Flecken im Inneren der Zelle.

• Zellen in einem Mantel. Thermotoga trägt eine lockere äußere Hülle, die „Toga“, die wie ein um mehrere Größen zu großer Schlafsack über die Enden der Zelle hinausquillt.

Die Form ist keine reine Zierde. Eine flache, quadratische Zelle verfügt über eine für ihr Volumen ungewöhnlich große Oberfläche, was in einem Lebensraum von Vorteil ist, in dem Nährstoffe rar sind. Hüllen und Togas sind strukturelle Merkmale, die Zellen zusammenhalten oder sie schützen. Organismen, die lange Fäden oder dichte Bündel bilden, verhalten sich zudem bei der Filtration und Probenvorbereitung anders, was von Bedeutung ist, wenn das Ziel darin besteht, Zellen aus einem großen Volumen an Formationswasser zu konzentrieren.

Vier Morphologien methanogener Archaea. Oben links: Autofluoreszenz von Methanospirillum hungatei (Spirillum). Oben rechts: Transmissionselektronenmikroskopie von mit Pt/C geschattetem Methanofollis propanolicus (unregelmäßige Kokken). Unten links: Transmissionselektronenmikroskopie von negativ gefärbtem Methanobacterium cahuitense (Stäbchen). Unten rechts: Autofluoreszenz von Methanosarcina sp. (Sarcina).

Autofluoreszenz unter dem Mikroskop

Einige Zellbestandteile strahlen von selbst Licht aus, wenn sie mit der richtigen Wellenlänge beleuchtet werden, ohne dass ein Farbstoff zum Einsatz kommt. Diese Autofluoreszenz ist eine der schnellsten Methoden, um die Zusammensetzung einer Probe einzugrenzen.

Methanogene leuchten blaugrün. Die Quelle ist das Coenzym F420, ein für den Energiestoffwechsel der Methanogene zentraler Cofaktor, dessen Leuchtkraft je nach physiologischem Zustand der Kultur variiert. Cyanobakterien fluoreszieren rot, angetrieben durch Chlorophyll a und die Phycobiliproteine ihres Lichtsammelsystems, wodurch sich photosynthetische Zellen leicht von allem anderen in einer gemischten Probe trennen lassen. Bei Clostridien wurde eine hellgelbe bis grüne Autofluoreszenz beschrieben.

Die Technik hat jedoch Grenzen, die man kennen sollte. Mineralpartikel, Pflanzenreste und manche Kunststoffe fluoreszieren ebenfalls, und ein Signal allein bestätigt eher eine Gruppe als eine bestimmte Art. Die Stärke der Autofluoreszenz liegt in der Vorauswahl: Sie zeigt dem Analytiker, welche Organismen eine genauere Untersuchung verdienen, bevor molekulare Untersuchungen beginnen.

Aufnahme der Autofluoreszenz einer methanogenen Archaeenart. Links: Epifluoreszenzmikroskopie, rechts: Phasenkontrastmikroskopie.

Koloniemorphologie auf Agar

Betrachtet man nicht mehr die einzelne Zelle, sondern eine auf festem Nährmedium wachsende Population, so weist diese eine ganz eigene Morphologie auf. Escherichia coli bildet runde Kolonien mit glatter Oberfläche und klarem Rand. Bacillus cereus verhält sich ganz anders: Er breitet sich im Schwarmwachstum mit federartigen, unregelmäßigen Rändern über den Agar aus, angetrieben durch koordinierte Bewegungen über die Oberfläche und nicht durch einfaches Wachstum von einem zentralen Punkt aus nach außen.

Die Koloniemorphologie ist eines der ältesten diagnostischen Werkzeuge in der Mikrobiologie und wird nach wie vor täglich genutzt, da sie fast nichts kostet und viel darüber verrät, wie sich ein Organismus verhält. Der Haken daran ist, dass die meisten Umweltmikroben überhaupt keine Kolonien bilden. Nur ein kleiner Teil der Mikroorganismen in einer Untergrundprobe wächst unter Standardbedingungen im Labor, und für Anaerobier aus Gasspeichern muss die Platte sauerstofffrei, ausreichend salzhaltig, mit den richtigen Elektronendonatoren und -akzeptoren versorgt und in manchen Fällen unter erhöhtem Druck gehalten werden. Organismen, die diese Bedingungen nicht erfüllen, hinterlassen keine Kolonie, die man beschreiben könnte – was einer der Gründe ist, warum die Hochdruckkultivierung für diese Art von Arbeit so wichtig ist.

Zusammensetzung der Gemeinschaft

Zellen unterscheiden sich auch darin, wie sie sich zueinander anordnen, und diese Anordnung ist oft aussagekräftiger als die Form einer einzelnen Zelle.

Escherichia coli trennt sich nach der Teilung sauber voneinander und tritt normalerweise als Einzelzellen auf. Andere Organismen bleiben paarweise zusammen und bilden die Diplo-Anordnung, bei der zwei Zellen nach der Teilung miteinander verbunden bleiben. Streptococcus teilt sich entlang einer einzigen Ebene, und die Tochterzellen halten sich aneinander fest, wodurch die Ketten entstehen, die der Gattung ihren Namen geben. Am anderen Ende steht der Biofilm, in dem sich Zellen in eine Matrix aus abgesonderten Polymeren einbetten und sich überhaupt nicht mehr wie Einzelzellen verhalten. Desulfomicrobium aggregans ist ein Beispiel für einen Sulfatreduzierer, der sich auf diese Weise aggregiert.

Biofilme sind der Punkt, an dem die Mikrobiologie für Infrastrukturbetreiber keine rein akademische Angelegenheit mehr ist. An einer Stahloberfläche haftende sulfatreduzierende Bakterien erzeugen direkt am Metall Bedingungen, die sich mit der Chemie von Flüssigkeiten im großen Maßstab nicht vorhersagen lassen, und genau in diesem Umfeld entsteht mikrobiell bedingte Korrosion. Eine Flüssigkeitsprobe kann voller planktonischer Zellen sein, während sich die Gemeinschaft, die tatsächlich den Schaden verursacht, in einem wenige hundert Mikrometer dicken Film an der Rohrwand befindet. Das Erkennen von Aggregaten und Biofilmfragmenten in einer Probe ist ein Hinweis darauf, dass die sessile Population Beachtung verdient, und es beeinflusst die Entscheidung, was als Nächstes beprobt werden sollte.

Schwimmender Biofilm des Sulfatreduzierers Desulfomicrobium aggregans, gezüchtet in einer Serumflasche. Die dunkle Biomasse sammelt sich an der Oberfläche und an der Glaswand, während das Medium klar bleibt.

Mikroskopie und Sequenzierung

Die Morphologie kann die Sequenzierung nicht ersetzen. Nicht verwandte Organismen weisen unter Umständen dieselben Formen auf – ein Stäbchen ist ein Stäbchen, egal ob es Sulfat reduziert oder Zucker fermentiert –, und kein Mikroskop kann allein anhand der Umrisse eine Identifizierung auf Artenebene vornehmen. Das Gegenteil trifft ebenso zu. Eine Sequenz liefert einen Namen, aber keinen Hinweis darauf, ob die Zellen lebendig, aggregiert, filamentös oder an etwas haftend waren.

Erst die Kombination beider Verfahren vervollständigt das Bild. Die mikroskopische Untersuchung einer frischen Probe zeigt, wie die Gemeinschaft aussieht und wie sie grob organisiert ist; die Autofluoreszenz kennzeichnet die funktionellen Gruppen, die es zu untersuchen lohnt; die Kultivierung zeigt, was noch wachsen kann; und die 16S-Profilierung liefert die Namen.

Mikroben sind keine einheitliche graue Masse aus Stäbchen und Kugeln. Es gibt sie in Form von Quadraten, Spiralen, Bündeln und umhüllten Filamenten; sie leuchten je nach Stoffwechsel in unterschiedlichen Farben und ordnen sich als Einzelgänger, Paare, Ketten und dichte Gemeinschaften an. Das Erkennen dieser Merkmale dauert nur wenige Minuten und prägt jede nachfolgende Entscheidung.