Isolierung anaerober Mikroorganismen

Öffnet man auf einem Labortisch eine Probenflasche aus einem sauerstofffreien Gasspeicher ist das meiste, was darin lebte, bereits tot. Nicht beschädigt, nicht gestresst. Tot – innerhalb von Sekunden nach dem Kontakt mit Luft. Diese eine Tatsache bestimmt alles rund um die Isolierung anaerober Mikroorganismen, ein Fachgebiet, bei dem der schwierigste Teil meist nicht die Mikrobiologie ist, sondern die Tatsache, dass Sauerstoff aus jedem Behälter, jedem Ventil und jeder Spritze ferngehalten werden muss. Die anaerobe Kultivierung ist mittlerweile die Grundlage für die Biogasproduktion, die Sicherheit bei der Wasserstoffspeicherung, die Kohlenstoffabscheidung und eine wachsende Liste industrieller Prozesse – und all das beginnt damit, lebende Organismen aus Umgebungen zu gewinnen, die niemand exakt nachbilden kann.

1. Was sind anaerobe Mikroorganismen und worin unterscheidet sich die anaerobe Kultivierung?

2. Welche Biotechnologien basieren auf anaerober Kultivierung?

3. Was macht die Isolierung anaerober Mikroorganismen so schwierig?

4. Welche Strategien unterstützen die erfolgreiche Isolierung anaerober Mikroorganismen?

5. Wie lassen sich die Grenzen der anaeroben Kultivierung überwinden?

6. Bei welchen Stämmen lohnt sich die Isolierung anaerober Mikroben?

Was sind anaerobe Mikroorganismen und worin unterscheidet sich die anaerobe Kultivierung?

Anaerobe Mikroorganismen sind Bakterien und Archaea, die ohne Sauerstoff gedeihen. Anstatt Sauerstoff zu atmen, verwerten sie Nitrat, Sulfat, Eisen(III), elementaren Schwefel oder Kohlendioxid, oder sie vergären organisches Material und kommen ganz ohne externen Elektronenakzeptor aus. Die Gruppe lässt sich in zwei praktische Kategorien unterteilen. Fakultative Anaerobier vertragen Sauerstoff und wechseln je nach Verfügbarkeit zwischen aerobem und anaerobem Stoffwechsel. Obligat anaerobe Organismen sind dazu nicht in der Lage. Ihnen fehlt ein vollständiger Satz an Enzymen zur Neutralisierung reaktiver Sauerstoffspezies, sodass der Kontakt mit Luft ihre Proteine innerhalb von Sekunden bis Minuten schädigt. Die anaerobe Kultivierung existiert aufgrund dieser zweiten Gruppe. Jede gestalterische Entscheidung im Labor, von der Gasphase in einer Flasche bis hin zur Wahl des Verschlussmaterials, folgt einer einzigen Prämisse: Sauerstoff darf niemals in die Kultur gelangen. 

Anaerobier kommen überall dort vor, wo Sauerstoff schneller verbraucht wird, als er ersetzt werden kann. Der Pansen und der Darm von Wiederkäuern beherbergen dichte Gemeinschaften von Fermentern und Methanogenen. Biogasanlagen arbeiten unter kontrollierten Bedingungen nach demselben Prinzip. Unterirdische Gasspeicher, Aquifere und erschöpfte Erdgas- oder Erdöllagerstätten beherbergen in der Tiefe anaerobe Populationen, oft unter erheblichem Druck oder bei hohem Salzgehalt. Mangroven- und Sumpfsedimente werden bereits wenige Millimeter unter der Oberfläche sauerstofffrei. Auch industrielle Infrastruktur gehört auf diese Liste, da sich in Rohrleitungen, Kühlkreisläufen, Injektionsbohrlöchern und Wasserführenden Systemen, insbesondere in metallverarbeitenden Betrieben, unter Ablagerungen und Biofilmen sauerstofffreie Zonen bilden, in denen in der Regel mikrobiell beeinflusste Korrosion beginnt. Fermentierte Lebensmittel runden das Bild ab, von Sauerkrautgläsern bis hin zu Sauerteig-Starterkulturen. Jeder dieser Lebensräume setzt seine eigenen Rahmenbedingungen für die anaerobe Kultivierung, weshalb ein Protokoll, das bei Klärschlamm funktioniert, bei Formationswasser aus 1.500 Metern Tiefe oft versagt.

Tropische Mangrovemit stehendem, sedimentreichem Wasser. Unterhalb der obersten Millimeter dieser Sedimente ist der Sauerstoff aufgebraucht, und anaerobe Gemeinschaften aus Fermentern, Sulfatreduziern und Methanogenen übernehmen die Vorherrschaft.

Welche Biotechnologien basieren auf anaerober Kultivierung?

Ein Teil der Antwort findet sich in den meisten Kühlschränken. Milchsäurebakterien wie Lactobacillus- und Lactococcus-Arten sind die treibende Kraft hinter Joghurt, Sauerkraut und Kimchi und arbeiten unter den sauerstoffarmen Bedingungen, die sie selbst schaffen, während sie das Substrat versäuern. Die Energieerzeugung ist der zweite große Bereich. Biogasanlagen wandeln landwirtschaftliche Reststoffe durch eine Kette aus fermentierenden Bakterien, Acetogenen und methanogenen Archaeen in Methan um. Power-to-Gas- und Power-to-Methane-Konzepte nutzen dieselben Methanogenen, um überschüssigen Strom aus erneuerbaren Energien über Wasserstoff in Methan umzuwandeln, das in bestehende Gasnetze eingespeist werden kann. Die biologische Wasserstoffproduktion durch Dunkelfermentation gehört zur gleichen Familie anaerober mikrobieller Prozesse.

Anaerobier sind zudem effiziente Produzenten industriell relevanter Chemikalien oder deren Vorläufer. Acetogene binden Kohlendioxid und Kohlenmonoxid zu Acetat, das als Grundchemikalie und als Ausgangsstoff für die weitere Umwandlung dient. Einzelne Metabolite und intrazelluläre Verbindungen haben engere, aber höherwertige Verwendungszwecke, darunter Enzyme für die Molekularbiologie, Pigmente und Vorläuferstoffe für die pharmazeutische Synthese. Jeder dieser Prozesse ist nur so zuverlässig wie der dahinterstehende Stamm, weshalb der anaerobe Anbau im Labormaßstab jeder Anwendung im Anlagenmaßstab vorausgeht. Das wachsende industrielle Interesse an der gas- und reststoffbasierten Umwandlung treibt zudem die Nachfrage nach der Isolierung anaerober Mikroorganismen aus Standorten voran, an denen bisher noch keine Probenahmen stattgefunden haben.

Was macht die Isolierung anaerober Mikroorganismen so schwierig?

Die Organismen selbst. Anaerobier sind weitaus weniger gründlich erforscht als Aerobier, und viele der aus unterirdischen oder industriellen Standorten isolierten Stämme haben keine kultivierbaren Verwandten, deren Protokoll man einfach kopieren könnte. Der Stoffwechsel ist oft so ungewöhnlich, dass sich das Substrat, das ein Stamm tatsächlich nutzt, und die Bedingungen, unter denen er es nutzt, nicht anhand der Taxonomie vorhersagen lassen. Die Medienkonzeption und die Substratauswahl werden dann zum Hauptschwerpunkt der Problemlösung eines Projekts und sind nicht mehr nur ein vorbereitender Schritt.

• Probenahme. Material, das aus einer Hochdruckformation entnommen wird, verliert seine ursprüngliche Gasphase, sobald der Druck abfällt, und das Eindringen von Sauerstoff während des Transports tötet obligat anaerobe Organismen sofort ab. Die Ausrüstung muss geschlossen und vorab reduziert sein und bei Arbeiten unter der Erdoberfläche für hohen Druck ausgelegt sein; maßgeschneiderte Lösungen sind die Regel, da sich keine zwei Probenahmestellen gleich verhalten.

• Handhabung im Labor. Jeder Transfer, jede Verdünnung und jede Beimpfung muss unter einer sauerstofffreien Gasphase erfolgen, sei es in einer Anaerobkammer oder durch das Septum eines Hochdruckbehälters. Eine einzige nicht gespülte Spritze macht wochenlange Arbeit zunichte.

• Ausrüstung und Fachwissen. Hochdruckautoklaven, wasserstoffdichte Armaturen und Begasungsverteiler sind teuer, und die Materialien müssen gleichzeitig druckbeständig, sterilisierbar und für die Kultur ungiftig sein. Der Aufbau eines Teams, das anaerobe Arbeiten unter Hochdruck sicher durchführt, erfordert jahrelange Ausbildung und praktische Erfahrung – keinen Kurzlehrgang.

• Wartung. Eine Anaerobenkammer ist zwar sauerstofffrei, aber nicht steril. Routinemäßige Aufgaben wie das Ausstreichen auf festem Agar sind anfällig für Kontaminationen, sofern Sterilisationsprotokolle und Wartungspläne nicht strikt befolgt oder von Grund auf neu entwickelt werden.

Keines dieser Hindernisse ist für sich genommen unüberwindbar. Zusammen erklären sie jedoch, warum die Isolierung anaerober Mikroorganismen nach wie vor eine Spezialdienstleistung und kein routinemäßiges Laborverfahren ist.

Welche Strategien unterstützen die erfolgreiche Isolierung anaerober Mikroorganismen?

Isolierung bedeutet, eine Reinkultur aus einer einzigen Zelle zu gewinnen, sodass alle anschließend durchgeführten Messungen einem einzigen Organismus zugeordnet werden können. Die Isolierung anaerober Mikroorganismen entspricht genau dieser Definition - lediglich die Rahmenbedingungen ändern sich. Beide klassischen Verfahren führen auch bei Anaerobiern zum Ziel, müssen jedoch jeweils angepasst werden.

• Flüssigisolierung in Serumflaschen unter Überdruck. Verdünnungsreihen, die in verschlossenen Flaschen mit einem definierten Gasraum durchgeführt werden. Dieser leichte Überdruck erhöht die Gaslöslichkeit im Medium und hält Luft durch eventuelle Undichtigkeiten fern, da Leckagen dann nach außen statt nach innen verlaufen.

• Hungate-Röhrchen. Das Low-Tech-Pendant zu Hochdrucksystemen, das auf Butylkautschukstopfen und einen kontinuierlichen Gasstrom bei jedem Transfer setzt. Geeignet für kleinere Volumina und eine hohe Probenanzahl.

  
  

• Hochdruckbehälter. Erforderlich für Organismen aus tiefen Reservoirs, deren Wachstum oder Stoffwechsel von Bedingungen abhängt, die bei atmosphärischem Druck nicht reproduzierbar sind, oder für Hochdrucksimulationen. Unser patentiertes Hochdruck-Probenahme- und Kultivierungssystem arbeitet mit bis zu 170 bar.

• Feststoffisolierung auf Agarplatten in Anaerobentöpfen. Einzelkolonien bleiben der direkteste Nachweis für Reinheit, vorausgesetzt, der Stamm verträgt den Ausplattierungsschritt.

Hungate-Röhrchen mit Butylstopfen und Schraubverschlüssen, bereit für Verdünnungsreihen, sowie eine versiegelte Serumflasche, die ein definiertes anaerobes Medium unter einer kontrollierten Gasphaseenthält.

Wie lassen sich die Grenzen der anaeroben Kultivierung überwinden?

Für die meisten bekannten Grenzen der anaeroben Kultivierung gibt es Lösungen, und diese sind weniger ausgefallen, als die erforderliche Ausrüstung vermuten lässt. Die schrittweise Anreicherung ist die Standardlösung für eine Probe, aus der sich keine Reinkultur direkt gewinnen lässt. Anstatt sofort eine Einzelzellisolierung zu erzwingen, wird die mikrobielle Gemeinschaft über mehrere Phasen hinweg durch Anpassung von Substrat, Temperatur, Salzgehalt, pH-Wert und Elektronenakzeptor in Richtung des Zielorganismus gelenkt. Mit jeder Passage wird die Population ein wenig weiter eingegrenzt. Eine gezielte mikrobielle Isolierung nach diesem Prinzip kann Wochen bis Monate dauern, wandelt jedoch eine unbrauchbare Mischprobe in etwas um, das sich tatsächlich mittels einer Verdünnungsreihe auflösen lässt.

Die Gestaltung der Nährmedien ist mindestens ebenso wichtig. Ein Medium, das den ursprünglichen Lebensraum nachahmt, liefert bessere Ergebnisse als ein Rezept aus dem Lehrbuch, und entscheidend sind dabei die Zusammensetzung der Spurenelemente, das Reduktionsmittel, das Puffersystem, der Salzgehalt und die Gasphase. Die Geochemie des Standorts ist der beste verfügbare Anhaltspunkt für Lebensräume im Untergrund. Das ist auch der Grund, warum Organismen aus Sole und Salzkavernen Medien benötigen, die auf ihre ionische Umgebung zugeschnitten sind, anstatt auf eine Standard-Salzkonzentration. Die Gestaltung solcher Nährmedien ist der wirksamste Einzelhebel bei der anaeroben Kultivierung und zugleich derjenige, der sich am wenigsten auf andere Projekte übertragen lässt.

Was einen ansonsten soliden Ansatz zunichte macht, ist meist ein Nebeneffekt. Am häufigsten treten syntrophische Partnerschaften auf: Wasserstoffproduzierende Fermenter und wasserstoffverwertende Methanogene sind so eng voneinander abhängig, dass eine Trennung beider Kulturen zum Absterben beider führt. Quorum-Sensing-Signale können bei sinkender Zelldichte ausbleiben. Auf nährstoffreichen Medien überwuchern schnell wachsende Konkurrenten den Zielorganismus. Unbekannte Wachstumsfaktoren, die von Nachbarn bereitgestellt werden, verschwinden mit ihnen. Mischkulturen, die Zugabe von verbrauchtem Medium und selektive Hemmstoffe sind die üblichen Gegenmaßnahmen, und eine gezielte mikrobielle Isolierung hängt oft davon ab, welcher Effekt zuerst identifiziert wird. Die anaerobe Kultivierung schreitet in der Regel dadurch voran, dass jeweils eine falsche Annahme nach der anderen beseitigt wird.

Anaerobe Kultivierung von Mikroorganismen in Serumflaschen mit visueller Kontrolle des Mikrobenwachstums.

Bei welchen Stämmen lohnt sich die Isolierung anaerober Mikroben?

Nicht jeder Anaerobier rechtfertigt den Geräteaufwand und die monatelange Arbeit, die die Isolierung anaerober Mikroben erfordert. Diejenigen, bei denen dies der Fall ist, stehen in der Regel am Anfang einer Wertschöpfungskette, für die es kein aerobes Äquivalent gibt.

• Biokraftstoffe und erneuerbare Energien. Methanogene Archaea wie Arten der Gattung Methanothermobacter treiben den „Power-to-Methane“-Prozess an, während lösungsmittelbildende Clostridien Aceton und Butanol produzieren.

• Kohlenstoffabscheidung und -verwertung. Acetogene, darunter Clostridium ljungdahlii, wandeln Kohlenmonoxid und Kohlendioxid in Ethanol, Acetat und weitere Chemikalien um. Die Druckgasfermentation verbessert den Übergang schwer löslicher Gase in die flüssige Phase, was normalerweise der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist.

• Industriechemikalien. Butanol, organische Säuren und Vorläufer für Biokunststoffe stammen größtenteils aus Clostridien.

  
  

• Zellbestandteile und Biomoleküle. Der Organismus selbst kann das Produkt sein und nicht nur das, was er ausscheidet. Membranlipide von Archaeen werden derzeit als Träger für Impfstoffe und die Wirkstoffabgabe entwickelt, da sie dort stabil bleiben, wo herkömmliche Liposomen versagen; sauerstoffempfindliche Enzyme aus strengen Anaerobiern dienen der Molekularbiologie und der Biokatalyse, und dissimilatorische Metallreduktoren wie Shewanella und Geobacter fällen Metallnanopartikel aus, die als Katalysatoren und Halbleitermaterialien von Interesse sind.

• Abfallbehandlung und Recycling. Fermenterkonsortien liefern Biogas und einen Rückstand in Düngemittelqualität, und die Hochdruckvergärung wurde als Verfahren untersucht, um den Methangehalt des Rohgases direkt zu erhöhen.

• Biomining und Metallrückgewinnung. Eisen- und schwefelumwandelnde Anaerobier mobilisieren kritische Metalle aus Erzen und industriellen Abfallströmen.

  
  

Die Isolierung anaerober Mikroorganismen erfordert Ausrüstung, Fachwissen und Geduld – und nichts davon lässt sich improvisieren. Damit eröffnet sich ein biotechnologisches Spektrum, das keine aerobe Entsprechung hat: von Energieträgern, Biokunststoffen und Nanomaterialien bis hin zu neuartigen Lebensmitteln sowie Enzymen und Chemikalien, die sonst nirgendwo auf der Erde zu finden sind. Anaerobier sind bemerkenswerte Organismen, und die Mühe, sie in Kultur zu bringen, lohnt sich.