DNA-Extraktion und Metagenom-Sequenzierung in der Mikrobiologie

Schätzungen zufolge wurden bisher nur 1–2 % aller Mikroorganismen auf der Erde im Labor kultiviert. Das bedeutet, dass die überwiegende Mehrheit der Bakterien und Archaeen nicht mittels einer lebenden Kultur untersucht werden kann und DNA oft die einzige zuverlässige Informationsquelle darüber ist, welche Mikroben in einer Probe vorhanden sind, welche Funktionen sie erfüllen und wie viele es davon gibt. Dieser Artikel zeigt, wo mikrobielle DNA vorkommt, wie sich Bakterien und Archaeen auf molekularer Ebene unterscheiden, wie DNA extrahiert wird und welche Sequenzierungs- und Quantifizierungsmethoden eine Probe in verwertbare Metagenomdaten umwandeln. Außerdem wird erläutert, wo verzerrte Daten den Analyseprozess beeinflussen können.

Inhaltsverzeichnis:

1. Was ist DNA und was kodiert sie in einem Mikroorganismus?

2. Wo findet man mikrobielle DNA aus lebenden Zellen?

3. Was kann DNA aus toten Zellen über Mikroben der Vergangenheit verraten?

4. Inwiefern unterscheidet sich die DNA von Bakterien und Archaeen?

5. Wie lässt sich DNA aus Mikroorganismen gewinnen?

6. Mit welchen Sequenzierungsmethoden lassen sich die Mikroben in einer DNA-Probe identifizieren?

7. Wie wird die DNA mittels qPCR und digitaler PCR quantifiziert?

8. Was sind die wichtigsten Fallstricke und Verzerrungen bei der DNA-Analyse?

9. Warum ist eine sorgfältige DNA-Analyse wichtig?

Was ist DNA und was kodiert sie in einem Mikroorganismus?

Desoxyribonukleinsäure ist ein langes Molekül, das aus zwei Strängen besteht, die sich in einer Doppelhelix umeinander winden. Jeder Strang ist eine Kette aus Zucker- und Phosphateinheiten, und an jeden Zucker ist eine von vier Basen gebunden: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C). A paart sich immer mit T, und G paart sich immer mit C, wodurch eine Zelle ihr Genom vor der Teilung exakt kopieren kann. 

Die Reihenfolge dieser Basen ist der Code. Abschnitte dieser Sequenz bilden Gene, die Anweisungen für Proteine enthalten, wie beispielsweise die Enzyme, die ein Methanogen zur Produktion von Methan oder ein Sulfatreduzierer zur Erzeugung von Schwefelwasserstoff benötigt. Die Bestimmung dieser Reihenfolge wird als Sequenzierung bezeichnet, und die Gesamtheit aller Gene eines Organismus bildet dessen Genom. Wenn Wissenschaftler das genetische Material einer gesamten Gemeinschaft auf einmal sequenzieren, entsteht ein Metagenom: ein kombinierter Katalog aller in der Probe vorhandenen Genome, von den dominanten Arten bis hin zu seltenen Vertretern. Der Vergleich eines Metagenoms mit einem anderen, beispielsweise vor und nach einer Veränderung der Betriebsbedingungen, zeigt, wie eine Gemeinschaft reagiert.

Abgleich verschiedener DNA-Sequenzen. Unterschiedliche Basen weisen auf genetische Unterschiede zwischen verschiedenen Arten hinsichtlich des untersuchten Gens hin.

Wo findet man mikrobielle DNA aus lebenden Zellen?

Mikroben besiedeln nahezu jede Umgebung auf der Erde, und ihr genetisches Material ist genau dort ebenfalls zu finden. Böden, Seen und Ozeane beherbergen riesige mikrobielle Populationen, ebenso wie der menschliche Darm und die Oberflächen von Pflanzen. Weniger offensichtliche Lebensräume sind für die Industrie ebenso wichtig. Poröses Gestein kilometerweit unter der Oberfläche, Formationswasser in unterirdischen Gasspeichern, Kühlwasserkreisläufe, Sole und die Innenwände von Rohrleitungen beherbergen allesamt aktive Gemeinschaften, die oft als Biofilme organisiert sind. 

Einige dieser Standorte sind extrem. Gesättigte Salzsole ist die Heimat von Halophilen, während heiße Lagerstätten wärmeliebende Archaea begünstigen. Viele tiefliegende Lebensräume sind zudem anaerob und stehen unter hohem Druck, was die Entnahme von Zellen ohne deren Störung zu einer technischen Herausforderung macht, für deren Lösung spezielle Hochdruck-Probenahmeverfahren entwickelt wurden.

Mithilfe einer Technik der langsamen Dekompression bleiben die mikrobiellen Zellen intakt und lebendig. Die Ergebnisse sind sogar innerhalb der Proben sichtbar.

Zwei Wasserproben von derselben Entnahmestelle. Links: Entnommen mit einem Hochdruckprobenehmer. Rechts: Entnommen bei Umgebungsdruck.

Was kann DNA aus toten Zellen über Mikroben der Vergangenheit verraten?

Nicht jedes Genfragment in einer Probe stammt von einem lebenden Organismus. Wenn Zellen absterben, wird ihr genetisches Material entweder in die Umgebung freigesetzt oder bleibt in intakten, aber inaktiven Zellen eingeschlossen. Diese Relikt- oder extrazelluläre DNA kann je nach Temperatur, enzymatischer Aktivität und sogar je nach Mineraloberflächen Tage bis Tausende von Jahren überdauern. Insbesondere Tonpartikel binden sie und schützen sie vor dem Abbau.

Reliktmaterial ist nützlich und problematisch zugleich. Permafrost, Seesedimente und Salzkerne bewahren genetische Spuren, anhand derer Forscher rekonstruieren können, welche Mikroben dort vor langer Zeit lebten. In einem aktiven industriellen System hingegen trüben dieselben Rückstände das Bild, da sich lebende und tote Zellen allein durch Sequenzierung nicht unterscheiden lassen. Ein Metagenom aus Boden oder Sediment kann einen erheblichen Anteil an Sequenzen von Zellen enthalten, die nicht mehr leben; eine Studie schätzt diesen Anteil in Böden auf etwa 40 Prozent. Behandlungen mit Propidiummonoazid (PMA), das genetisches Material aus Zellen mit beschädigter Membran vor der Amplifikation chemisch maskiert, helfen dabei, lebende von toten Signalen im endgültigen Metagenom zu trennen.

Inwiefern unterscheidet sich die DNA von Bakterien und Archaeen?

Auf chemischer Ebene gibt es keinen Unterschied. Die gleichen vier Basen und die gleiche Doppelhelix finden sich in Pflanzen, Pilzen, Menschen und jedem Mikroorganismus. Die Unterschiede liegen darin, wie das Molekül gepackt ist, wie seine Basen ausbalanciert sind und wie schwer es zu erreichen ist.

• Anordnung: Bakterien verdichten ihre DNA mithilfe von nukleoidassoziierten Proteinen wie HU (hitzelabiles Nukleoidprotein) und H-NS (histonähnliches Nukleoidstrukturierungsprotein) zu einem Nukleoid, während viele Archaeen ihre DNA um Histonproteine wickeln, die denen in menschlichen Zellen ähneln.

• Basenzusammensetzung: Der Anteil der G- und C-Basen in der DNA, bekannt als GC-Gehalt, reicht bei Mikroben von unter 20 Prozent bis über 70 Prozent, wobei viele Haloarchaea am oberen Ende dieser Skala liegen.

• Zugänglichkeit: Die Zellhülle entscheidet darüber, wie leicht DNA freigesetzt werden kann, und genau hier unterscheiden sich die beiden Domänen am stärksten.

 Bakterielle Zellwände bestehen aus Peptidoglykan, das von Enzymen wie Lysozym abgebaut werden kann. Archaea verfügen überhaupt nicht über Peptidoglykan. Methanogene wie Methanobacterium und Methanothermobacter nutzen Pseudomurein, das gegen Lysozym resistent ist, während Methanosarcina dicke Polysaccharidschichten um Zellcluster bilden können. Einige Haloarchaea hingegen platzen auf, sobald das umgebende Salz entfernt wird. Diese Unterschiede wirken sich direkt darauf aus, wie viel von jeder Gruppe nach der Sequenzierung im Metagenom landet.

Anreicherungskulturen in verschiedenen Nährmedien erhöhen die Wahrscheinlichkeit, verschiedene Zielgruppen von Bakterien und Archaea zu züchten. 

Wie lässt sich DNA aus Mikroorganismen gewinnen?

Jede Extraktion folgt derselben Logik: Die Zellen werden aufgebrochen, das genetische Material freigesetzt und von Proteinen, Membranen, Salzen und anderen Verunreinigungen getrennt. In Laboren kommen drei verschiedene Verfahren zum Einsatz.

• Bei der chemischen Lyse werden Detergenzien wie SDS, chaotrope Salze und Enzyme wie Lysozym oder Proteinase K verwendet, um die Zellhüllen aufzulösen und die DNA freizusetzen.

• Bei der physikalischen Lyse werden die Zellen mechanisch durch Bead-Beating, Einfrier-Auftau-Zyklen oder Ultraschallbehandlung aufgebrochen, wodurch selbst widerstandsfähige Zellen geöffnet werden, die DNA dabei jedoch fragmentiert wird.

• Die Aufreinigung mit Phenol-Chloroform, Silikatsäulen oder Magnetkügelchen entfernt Inhibitoren und bereitet die DNA für die Analyse vor.

  
  

Der zentrale Kompromiss besteht zwischen Länge und Ausbeute. Kräftiges Bead-Beating bricht die größte Bandbreite an Mikroben auf und liefert hohe Mengen, doch das genetische Material liegt in kurzen Stücken vor. Schonende enzymatische Protokolle bewahren die langen, intakten Moleküle, die für die Long-Read-Sequenzierung benötigt werden, können jedoch widerstandsfähige Zellen wie Methanogene mit Pseudomurein-Zellwand unberührt lassen. Kommerzielle Kits sind schnell und reproduzierbar, können jedoch bei Proben mit geringer Biomasse schlechte Ergebnisse liefern und Spurenverunreinigungen enthalten, die in einem spärlichen Metagenom als falsche Signale auftreten. Die richtige Wahl hängt davon ab, ob das Ziel eine breit angelegte Metagenom-Untersuchung, ein vollständiges Genom oder eine empfindliche Zählung eines Zielorganismus ist.

Mit welchen Sequenzierungsmethoden lassen sich die Mikroben in einer DNA-Probe identifizieren?

Die qualitative Analyse beantwortet zwei Fragen: Wer ist vorhanden und wozu sind diese Mikroben fähig? Die Sequenzierungstechnologie hat drei Generationen durchlaufen. Die in den 1970er Jahren entwickelte Sanger-Sequenzierung liest jeweils ein Fragment mit hoher Genauigkeit aus und wird nach wie vor zur Bestätigung einzelner Gene oder Reinkulturen verwendet. Short-Read-Plattformen wie die Illumina-Sequenzierung lesen Millionen von Fragmenten parallel aus, die typischerweise 150 bis 300 Basen lang sind, was groß angelegte Gemeinschaftsstudien erschwinglich machte. Long-Read-Technologien, darunter die PacBio- und Nanopore-Sequenzierung, erzeugen Reads von vielen Tausend Basen, was dabei hilft, vollständige Genome aus einem komplexen Metagenom zusammenzusetzen. 

Zwei Ansätze dominieren die mikrobielle Forschung. Bei der 16S-Profilierung wird ein einzelnes Markergen, das 16S-rRNA-Gen, das jedes Bakterium und jedes Archaeon trägt, amplifiziert und gelesen. Dieses Verfahren ist kostengünstig und zeigt die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft, in der Regel bis auf Gattungsebene. Die Metagenomsequenzierung, oft auch als Shotgun-Sequenzierung bezeichnet, liest das gesamte genetische Material einer Probe aus, ohne zuvor ein bestimmtes Ziel zu amplifizieren. Ein Metagenom zeigt nicht nur, welche Organismen vorhanden sind, sondern auch, welche Stoffwechselgene sie tragen, und liefert bei ausreichender Sequenzierungstiefe aus dem Metagenom zusammengesetzte Genome von Arten, die noch nie kultiviert wurden. Die Sequenzierungstiefe, also die Anzahl der Reads pro Probe, entscheidet darüber, wie viele seltene Mitglieder in jedem Metagenom auftauchen.

Wie wird die DNA mittels qPCR und digitaler PCR quantifiziert?

Zu wissen, dass ein Sulfatreduzierer vorhanden ist, bedeutet nicht dasselbe wie zu wissen, ob es sich um zehn Zellen oder zehn Millionen handelt. Sequenzierungsdaten zeigen lediglich Anteile an, sodass für absolute Zahlen eine gezielte Quantifizierung neben der Metagenomsequenzierung erforderlich ist.

Die quantitative PCR (qPCR) verfolgt die Amplifikation eines ausgewählten Gens in Echtzeit mithilfe von Fluoreszenz. Je früher das Signal auftritt, desto mehr Kopien enthielt die Probe, und eine Standardkurve wandelt dieses Signal in Kopienzahlen um. Die digitale PCR teilt die Reaktion in Tausende winziger Partitionen auf, zählt, wie viele davon positiv werden, und berechnet absolute Kopienzahlen ohne Standardkurve. Sie verträgt zudem Inhibitoren besser, was bei ölhaltigen oder salzhaltigen Feldproben von Vorteil ist.

Typische Zielgene sind die gesamten 16S-rRNA-Gene von Bakterien oder Archaeen sowie funktionelle Gene wie dsrA für Sulfatreduzenten oder mcrA für Methanogene. In der Praxis ergänzen qPCR und digitale PCR die Sequenzierung: Das Metagenom zeigt, welche Gruppen von Bedeutung sind, und gezielte Assays verfolgen, wie sich deren Anzahl über Wochen oder Monate hinweg verändert.

Vorbereitung von qPCR-Proben in einer Reinraum-Arbeitsstation.

Was sind die wichtigsten Fallstricke und Verzerrungen bei der DNA-Analyse?

Jeder Schritt zwischen der Probenahme und den endgültigen Daten kann das Ergebnis verfälschen, und Fehler zu Beginn der Kette wirken sich bis zum Ende aus. Ein Metagenom ist nur so repräsentativ wie die ihm zugrunde liegende Probe.

• Probenqualität: Sauerstoffeinwirkung, Druckverlust, Verzögerungen oder Lagerung bei warmer Temperatur verändern die Lebensgemeinschaft oder zersetzen deren DNA, noch bevor die Analyse beginnt.

• Extraktion: Methoden, die widerstandsfähige Zellen übersehen, lassen deren DNA zurück und führen zu einer Unterrepräsentation dieser Gruppen im Metagenom.

• Primerdesign: Sogenannte universelle Primer passen schlecht zu bestimmten Abstammungslinien, sodass DNA von nicht passenden Gruppen bereits vor Beginn der Sequenzierung nur schwach oder gar nicht amplifiziert wird.

• Sequenzierungsmethode: Kurze Reads haben Schwierigkeiten mit repetitiven Regionen und extrem hohem GC-Gehalt, während lange Reads in der Vergangenheit höhere Fehlerraten aufwiesen und jede Plattform die DNA-Daten auf ihre eigene Weise verzerrt.

• Archaeen: Robuste Zellhüllen, divergierende 16S-Sequenzen und eine geringe Abdeckung in Referenzdatenbanken führen dazu, dass die DNA von Archaeen besonders leicht unterschätzt wird.

  
  

Die Genkopienzahl stellt eine weitere Komplexitätsebene dar. Bakterien tragen pro Genom zwischen einer und etwa 15 Kopien des 16S-rRNA-Gens, sodass eine hohe Kopienzahl nicht immer mit einer hohen Zellzahl einhergeht. Besondere Aufmerksamkeit gilt den Archaea, da Methanogene und andere Archaeen eine zentrale Rolle bei der Methanbildung und der Korrosion in Speicher- und Energiesystemen spielen. Ein auf Bakterien abgestimmtes Protokoll kann diese nahezu unsichtbar machen. Archaeen-spezifische Primer, angepasste Lyse-Schritte und Gegenprüfungen zwischen 16S-Profiling und Metagenom-Sequenzierung sind die zuverlässigsten Sicherheitsvorkehrungen.

Warum ist eine sorgfältige DNA-Analyse wichtig?

Mikrobielles genetisches Material enthält detaillierte Informationen darüber, welche Organismen in einem System leben und welche Funktionen sie dort erfüllen – jedoch nur, wenn es unter Berücksichtigung der jeweiligen Verzerrungen entnommen, extrahiert und analysiert wird. Die Kombination aus 16S-Profiling, Metagenomsequenzierung und gezielter Quantifizierung liefert das umfassendste Bild, insbesondere für Archaea, die bei Standardverfahren häufig übersehen werden.